تست غربالگری نوزادی به روش MS/MS برای ۳۴ بیماری متابولیک اولیه طراحی شده است و در حین این تست حدود ۲۴ بیماری دیگر هم به‌صورت ثانویه ممکن است شناسایی شود. متأسفانه این روش قادر به شناسایی تمام موارد بیماری‌های متابولیک که بیش از ۷۰۰ نوع را شامل می‌شود نبوده و تنها موارد شایع و قابل‌درمان را در بر می‌گیرد. درعین‌حال همین موارد شایع نیز چنانچه از نوع خفیف باشند ممکن است در تست غربالگری قابل تشخیص نباشند. در برخی از موارد نیز نتایج مثبت در تست غربالگری نوزادی ممکن است به دلیل ابتلا به بیماری متابولیکی نبوده و مربوط به علل محیطی و یا زایمانی باشد که موجب نتایج مثبت کاذب در تست می‌شوند.
ازاین‌رو برای مرحله دوم، تست‌های تکمیلی جهت تأیید، تشخیص و یا رد موارد مشکوک طراحی شده‌اند که شامل بررسی آمینواسیدهای خون به روش HPLC – آسیل کارنیتین‌های پلاسما به روش LC MS/MS- کروماتوگرافی آمینواسید و قند ادرار - بررسی اسیدهای ارگانیک ادرار به روش GC-MS و سایر تست‌ها مانند قند - اسید خون - آمونیاک - لاکتات و پیرووات - تست‌های کبدی و کلیوی – کتون ادرار و… است. در برخی موارد ممکن است نیاز به انجام تست‌های مرحله سوم مانند بررسی مایع مغزی– نخاعی و یا تست‌های تهاجمی مانند بیوپسی کبد - پوست یا عضله برای بررسی‌های آنزیمی نیز باشد.
انجام تست‌های تکمیلی نه‌تنها در مواردی که تست غربالگری مثبت می‌شود؛ بلکه در سایر مواردی که تست غربالگری نرمال بوده؛ اما علایمی دال بر بیماری‌های متابولیک مانند تأخیر تکاملی - تشنج بدون علت - شلی عضلانی - بزرگی کبد و طحال - استفراغ مکرر - افت قند خون - افزایش اسید و یا آمونیاک خون و… وجود داشته باشد، ضروری است.
در نهایت پزشک معالج بر اساس نتایج این تست‌ها قادر به تعیین نوع بیماری بوده و تست ژنتیک مرتبط با بیماری موردنظر را به‌منظور تشخیص قطعی و تأیید نهایی بیماری درخواست می‌نماید که برای انجام تست‌های پیش از تولد به‌عنوان یک تست پیش‌نیاز و ضروری است و بدون انجام آن امکان آمنیوسنتز و پیشگیری از تولد فرزند مبتلا وجود نخواهد داشت.
متأسفانه، در بسیاری از موارد بیومارکر مشخصی برای تشخیص قطعی بیماری وجود ندارد و ممکن است از همان ابتدا انجام تست‌های وسیع ژنتیکی مانند (Whole Exome Sequencing (WES به روش (Next Generation Sequencing (NGS برای تشخیص قطعی بیماری توصیه گردد.
بایستی توجه داشت که انتخاب نوع تست تکمیلی به عهده متخصص متابولیک است چرا که بسته به نوع بیماری احتمالی، آزمایش‌های متفاوتی وجود دارد که با محدودکردن آنها می‌توان از انجام موارد غیرضروری که اغلب گران و زمان بر نیز هستند اجتناب نمود.